分子间相互作用定量QCM装置基础知识

振荡法方式(QCM)

原理

水晶振动子(也称石英板),其结构为切成极薄的水晶振动子的两侧附着有金属薄膜,当对每个金属薄膜施加交流电场时,会表现出以特定频率(共振频率)振动的特性。当纳克物质吸附在金属薄膜上时,共振频率与物质的质量成比例地降低,因此可以用作为微量天平。这种方法称为QCM(Quartz Crystal Microbalance:水晶振动子微量天平)方法。以下是对该QCM法原理的简要介绍。

晶体的压电效应

在某些晶体中,当施加机械应变时,晶体中原子的位置关系发生变化,产生与应变的大小成比例的分极。这种现象称为压电效应(piezoelectric effect) ,是1880年由法国物理学家居里兄弟(Brothers Curie)发现的。

与此相反,如果在结晶上施加电场,则会产生机械性的应变(逆压电效应)。这些现象在水晶、罗谢尔盐、电气石等的结晶中也被发现,其中最特别是水晶(石英quartz;SiO2),由于在压电特性、化学性质、热稳定性方面优异性而被广泛使用。

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水晶振动子微量天平法

将晶体沿晶体方向切割成非常薄的板状,金属电极附着在薄片的两侧上,并使用振荡电路等向每个电极施加交流电场,水晶振动子将以一定的频率(共振频率)振动,该晶体单元简单,准确且提供稳定的频率,因此在诸如石英表和移动电话之类的通信设备中用作为参考频率。

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存在各种类型的水晶振动子,但是以一定角度切割,在水晶板薄膜的两面上附有电极的水晶振动子称为厚度切割模式谐振器(Thickness-shear-mode resonator),沿水晶面的水平方向振动。

此时的晶体单元的频率由晶体的厚度决定,并且薄的晶体板可以获得更高频率振动。20世纪50年代有报告称水晶板的频率是根据电极上的物质的质量而变化的。

频率变化量与附着物质量之间的关系由以下方程式表示,即Sauerbrey方程:频率随附着物量的增加而降低,频率随附着物量的减少而增加。使用这种现象通过检测水晶振动子的频率变化来测量电极上物质的质量变化的方法称为水晶振动子微量天平法(QCM方法)。

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过去,水晶振动子主要用于气相测量。理由如下,

①在液相等高粘度环境下,水晶振动子的振动会大大衰减,因此不会振动。
②因为水晶振子的结构是夹在金属薄膜中的绝缘体--水晶的一种电容器,在水中等存在两个电极通电等问题。
但是,到了1981年,发现即使在液相中也能振荡。
在振荡电路的改进和使水晶振荡元件的单面不接触液相等方面所做的改进,使水晶振荡元件在液相中的使用成为可能。

QCM在水中的使用已显着普及,并且在此之后的10年中,QCM已用于化学,生物化学和微生物学等各个领域。

QCM作为测量分子间相互作用的装置

Sauerbrey方程,右侧包含晶体单元的基频F0。
这表明晶体单元的基本频率越高,与频率的平方成正比的检测到的频率变化值越大,即,质量检测灵敏度越高。

Initium公司现已在全球首次成功投产采用高频基本频率水晶振动子的QCM装置,该装置使用了此前在水溶液中振荡困难的频率27MHz。

AFFINIX系列的传感器使用的具有27MHz基本振动频率的水晶振动子,
在理论上和实验上都证实1Hz的振动频率减少了 0.62 ng/cm2 的传感器表面上的质量增加。

这意味着检测信号比市场上常见的5MHz和9MHz晶体器件高29倍和9倍。
由于使用高频QCM可以提高检测灵敏度,因此可以将此前变化量小、难以观察到的生物体内各种分子(核酸、多肽、蛋白质、糖链、脂质单分子膜等)的相互作用情况按一定时间的频率变化进行检测。

另外,Initium的QCM产品通常每隔1秒获取振动数据,对质量的增减进行实时监控。
能实时监测表面上物质的吸附是非常重要的,也能获得物质的吸附速度等信息。

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总结QCM装置AFFINIX系列的特点,如下。

可以量化传感器表面纳克级的吸附量。
可以在接近天然状态下检测相互作用,而无需标记生物分子(例如蛋白质)。
吸附反应可以实时测量。

AFFINIX系列在结合反应中由于质量增加,振动频率减少,分解反应等质量减少,振动频率增加。
由此可以看出,可以用于金或SiO2等固体表面蛋白质等分子的吸附,高分子薄膜的吸附量的定量,以及监测它们的分离和分解。


另一方面,当量化两个分子之间的相互作用时,可以通过将任一分子固定在传感器表面上,任一分子添加到溶液中来监测吸附量进行测量。

固定在传感器表面的分子称为主体分子,添加到溶液中并与主体分子结合的分子称为客体分子。
在典型的结合反应的情况下(图),当向主体分子固定化基板添加了客体分子样本时,则与主体分子的结合反应开始。

客体分子的吸附量取决于浓度,通过分析此时各浓度的平衡值,可以求出表示主机分子与客体分子结合强度的解离常数(Kd值)。
另外,由于可以实时监测结合反应,通过分析结合时的吸附曲线可以求出反应速度相关的参数结合速度(kon)、解离速度(koff)的值。

解离常数为结合常数(Ka)的倒数,值越小,主分子和客体分子的亲和性(Affinity)越强。

然而,即使具有相同解离常数值的相互作用可能具有结合速度快,解离速度慢,或结合速度快,解离速度也快的情况。
在分析分子间相互作用的细节时,讨论结合速度和解离速度是非常重要的。

解离常数(结合常数)的实验可通过计算各浓度下的饱和吸附量⊿F,并将其绘制为横轴客体分子浓度和纵轴饱和吸附量来表示。
如果实验正确进行,则该图将是Langmuir型饱和度图,随着浓度的增加,该饱和度图将接近恒定值。
所得曲线可以通过非线性回归计算进行曲线拟合,以得出Kd和⊿Fmax的最佳组合。

有两种计算每种客体分子浓度的饱和吸附量的方法:
当添加客体样品并且吸附达到平衡时,再添加客体样品反复操作,求各客体分子浓度的平衡吸附量的方法。
和添加不同客体分子浓度客体样本的独立测定方法。
无论采用哪种方法,都可以求出各客体分子浓度下的平衡吸附量,原则上可以得到相同的值。


另外,重复进行添加不同客体分子浓度客体样本的独立测量的方法可以通过拟合吸附曲线算出与反应速度相关的参数
结合速度(kon)和解离速度(koff)。
Initium提供了一种软件AQUA,可以在对AFFINIX系列的相互作用测量数据进行分析的基础上,简单地计算传感图像的拟合和平衡常数。

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分子间相互作用定量QCM装置基础知识

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